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本制品是用于多重荧光探针检测的即用型qPCR试剂，可以同时对多个靶片段进行实时定量PCR分析。产品含有经过优化的缓冲液组分、热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂和稳定剂等所有qPCR所需要的成分，用户只需加入基因组DNA或cDNA模板、引物和探针即可进行探针法qPCR反应。

• 以2×Mix提供，用户只需准备模板、引物、探针和ROX染料（取决于qPCR仪器）即可以进行探针法qPCR实验，非常方便快捷，降低了操作误差。
  
• 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高、特异性强。灵敏度最高时可以达到50拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。
  
• 既可用于TaqMan探针qPCR，也可用于分子信标探针qPCR。
  
• 灵敏度和专一性比染料法qPCR更高。
  
• UNG防污染检测系统：添加UNG（Uracil N-Glycosylase），可以有效防止因PCR产物污染造成的假阳性结果。
  
• 可用于基因表达分析、SNP分析、拷贝数分析等实验。也可以用于定性检测。

• 如果有N个样品并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个是做标准曲线的阳性对照，一个是阴性对照(NC)。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照(PC)，用户自己需要根据下表进行适当修改(把6个标曲反应改成1个阳性对照反应)。
  

  成分		N个样品管	6个标准曲线管	NC管
  2×多重探针法qPCR Mix		各10μL	各10μL	10μL
  自备引物1(10μM)		各1μL	各1μL	1μL
  自备引物2(10μM)		各1μL	各1μL	1μL
  自备模板DNA	基因组DNA	10～100ng	不加	不加
  	cDNA	1～10ng	不加	不加
  自备阳性对照模板(6个梯度)		不加	各1μL(各加1个梯度)	不加
  阴性对照模板(一般用水)		不加	不加	1μL
  自备探针(0.5μM)		各1μL	各1μL	1μL
  自备50×ROX(如果需要)		各0.4μL	各0.4μL	0.4μL
  超纯水		至20μL	至20μL	至20μL

• 放入荧光PCR仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物和探针的Tm值、标记染料的种类等进行调节。
  
  • 一般选择三步法PCR：
    

    步骤	反应参数	备注
    预变性	94℃ 2min
    PCR循环 (35～45次）	94℃ 15sec	靶分子长度最好在80～200bp
    	55～65℃ 15～30sec	在此步采集荧光信号，通道根据标记染料决定
    	72℃ 30sec

  • 如果引物Tm值接近60℃，也可以选择两步法PCR：
    

    步骤	反应参数	备注
    预变性	94℃ 2min
    PCR循环 (35～45次)	94℃ 15sec	靶分子长度最好在80～200bp
    	60℃ 60sec	在此步采集荧光信号，通道根据标记染料决定

• 数据处理：
  
  • 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
    
  • 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照Ct大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。